案例文章
MicroRNAs （miRNAs）通过miRNA沉默过程调节植物和动物中数千种基因的表达，miRNA沉默过程参与多种重要的生理过程，包括上皮再生、心脏功能、排卵和癌症发展。Argonaute 2（Ago2）蛋白是miRNAs引导的基因抑制和沉默过程的主要载体，miRNA通过与Ago2形成RNA诱导沉默复合物（RNA- induced silencing complexes, RISCs），可作为识别互补靶mRNA的向导，并通过翻译抑制和降解引起特异性基因沉默。虽然人类Ago2（hAgo2）的晶体结构近年来已被揭示，但其与RNA识别的动态结构特征信息以及相应的蛋白质结构变化信息仍然缺乏。
本文采用分子动力学（MD）模拟的方法研究了hAgo2-RNA（有RNA结合）体系和hAgo2-free（无RNA结合）体系的动力学特性，为进一步了解Ago2-RNA识别的分子机制提供依据。
在这项研究中，研究人员构建了Ago2两种状态的模型：一个是与RNA结合的复合物体系（hAgo2-RNA），另一个是没有RNA结合的游离Ago2体系（hAgo2-free）。然后，进行了长时间的分子动力学模拟，并对模拟结果进行了多种分析，以探讨Ago2在这两种状态下的结构稳定性、灵活性、相互作用等动力学特征。通过比较这两个体系的动态特征，揭示了Ago2在RNA结合过程中的结构变化和功能性运动。
hAgo2和RNA复合物的晶体结构来源于PDB数据库 (PDB ID: 4W5Q)。其中hAgo2由四个球状结构域（N、PAZ、MID、PIWI）和两个链接结构域（L1和L2）组成，RNA包括guide RNA（g1-g21）和target-RNA（t1-t9）。由于蛋白质数据库中没有完整的游离hAgo2结构，因此从复合物结构中去除RNA结构以获得hAgo2-free体系。随后对构建的两个体系分别进行100 ns的分子动力学模拟。
RMSD是衡量分子在模拟过程中与初始结构之间偏差的标准指标。通过计算RNA结合和未结合Ago2的RMSD，研究者可以评估其结构的稳定性。Ago2-RNA体系中，蛋白的RMSD值在模拟过程中没有大幅波动，意味着蛋白的结构稳定保持在一个合理的范围内。在没有RNA结合的体系中，Ago2显示出较大的RMSD波动，表明Ago2结构较为灵活，RNA去除后蛋白发生了强烈的结构重排。
RMSF反映了蛋白质各个氨基酸残基的波动程度，可以揭示蛋白质结构中的柔性区域。没有RNA结合时，Ago2的结构显示出较高的RMSF（图k、m），特别是在一些连接区域和表面区域，表明这些部分更加灵活，结构稳定性较差。RNA结合后，Ago2的某些区域（如PIWI结构域）表现出较低的RMSF（图h、l），表明这些区域的运动较为受限，可能因为RNA的结合导致这些区域更加稳定。
氢键分析有助于了解分子之间的相互作用以及蛋白质内部的稳定性。在hAgo2-RNA体系中，观察到了18个强的直接氢键和23个水介导的氢键，主要分布在g2–g7段和RNA骨架与蛋白之间。这表明蛋白与RNA的相互作用主要由RNA骨架原子介导，与Ago2与miRNA的非特异性识别相一致。
DCCM（动力学交叉相关图）分析能够揭示蛋白质不同区域之间的协同运动或反向运动。为了研究hAgo2的内在结构特性，利用DCCM揭示了hAgo2两种状态下的相关运动（a：hAgo2-RNA、b：hAgo2-free）。颜色条表示从白色到红色再到黑色，相关系数从1（极正相关）到0（不相关）到−1（极负相关）。两幅图中的白色对角线表明，每个残基的运动与自身绝对正相关。从图中可以看出四个浅色方块位于对角线上，它们对应于hAgo2中的四个全局结构域：N（残基22-138）、PAZ（残基229-346）、MID（残基445-579）和PIWI（残基580-859）。在两个体系中，残基220-330和残基450-580之间存在很强的负相关，它们分别由PAZ和MID结构域组成。这表明PAZ和MID结构域在两个体系中进行相反方向的运动。在hAgo2-free体系中，正相关和负相关显著增强，表明hAgo2- free体系的构象变化更大。此外，N和PAZ域（残基22-450）与自身呈正相关，而与MID和PIWI域（残基451-859）呈负相关。这表明蛋白可以被分为两部分，这两部分在有或没有RNA结合时总是向相反方向移动。
PCA分析用于提取系统的基本运动模式。结果显示Ago2蛋白在有或无RNA结合状态下明显表现出不同的运动模式（a：hAgo2-RNA、b：hAgo2-free）。在hAgo2-RNA系统中，除了PAZ和PIWI/MID之间的轻微开放运动外，短得多的锥体长度意味着RNA结合的整个结构的稳定性。在hAgo2-free体系中，随着锥体长度的增加，检测到的构象变化更大，运动方向似乎与RNA结合体系相反，尤其是PAZ结构域。
自由能景观（FEL）分析有助于揭示复合物在不同构象下的稳定性，颜色越深表示能量越低。从图中可以看出（a：hAgo2-RNA、b：hAgo2-free），hAgo2-RNA体系主要存在两种低能构象状态，hAgo2-free低能状态更多，构象变化较为丰富。
本研究通过分子动力学模拟方法，详细研究了hAgo2与RNA的结合过程，从RMSD、RMSF、氢键分析、DCCM、PCA、FEL等多个方面出发，深入分析了Ago2-RNA识别的分子机制。基于研究结果推测PAZ结构域动态构象改变可能是hAgo2介导的miRNA诱导基因调控的关键因素。这些发现为理解Ago2在RNA干扰中的作用提供了深入的理论基础，并有助于未来在miRNA研究和基因表达调控方面的进一步探索。该研究成果已发表于学术期刊《Chemical biology & drug design》。
Kong R, Xu L, Piao L, et al. Exploring the RNA‐bound and RNA‐free human Argonaute‐2 by molecular dynamics simulation method[J]. Chemical biology & drug design, 2017, 90(5): 753-763.