案例文章
信号转导与转录激活因子3（STAT3）是一种重要的转录因子，在多种细胞生物学过程中发挥作用，包括细胞增殖、分化、凋亡和免疫反应。然而，STAT3在许多癌症中被异常激活，尤其是通过Janus激酶（JAK）介导的酪氨酸705（Tyr705）磷酸化后，STAT3在细胞核内形成二聚体，启动致癌基因的表达。因此，STAT3被认为是一个重要的抗癌药物靶点。然而，现有的STAT3抑制剂，如CJ-887等肽拟似物，在临床应用上受到限制，这促使研究人员转向小分子抑制剂的研发。尽管一些基于结构的小分子STAT3抑制剂已被发现，但它们通常存在结合亲和力弱的问题，这可能与靶标域（SH2域）的高灵活性有关，开发有效的小分子STAT3抑制剂仍具有较大挑战性。
本文通过计算与实验相结合的方式，成功鉴定出鉴两种高效、中性、低分子量的具有良好药物特性的STAT3抑制剂。这些抑制剂可通过干扰STAT3二聚化，阻止其活性，从而抑制STAT3信号通路并抑制肿瘤细胞的增殖。该研究为寻找具有高活性和良好药物特性的STAT3抑制剂提供了新的思路和方法。
为了解决STAT3 SH2结构域的高迁移率问题，研究人员首先通过分子对接技术获取STAT3与CJ-887(一种有效的STAT3类肽抑制剂)的复合物结构。接着对该复合物体系进行10 ns的分子动力学模拟，允许配体（CJ-887）和蛋白质（STAT3）进行充分的构象调整，以获取STAT3 SH2域的诱导活性位点结构。然后，提取MD轨迹中复合物体系的平均结构，进一步优化，作为虚拟筛选的受体模型。
分子对接时，从PDB数据库中下载STAT3结构（PDB ID：1BG1）,删去不必要的分子后得到如图A和B所示的结构（绿色为STAT3，橘色为pY705肽配体），作为分子对接的受体结构。配体CT-887的二维结构如图D所示，在OPLS力场下进行能量优化，并生成多个可能的构象。此外，对接盒子设置以E638为中心，包围位于磷酸化肽所在20 Å范围内的残基。图C展示了STAT3与CJ-887对接后的复合物结构。可以看出，CJ-887与残基K591、R609、E638形成了丰富的氢键网络。
在对复合物结构进行10 ns的MD模拟后，提取最后2 ns轨迹的平均结构（图E）与初始结构进行叠合（图F），发现平均结构的pY+0口袋有所变大，从而有利于配体结合。随后使用AMBER11对该平均结构进行4000步的能量最小化，包括2000步的最速下降算法和2000步的共轭梯度算法，优化后的结构用作虚拟筛选的受体结构。
研究人员采用基于结构的虚拟配体筛选（SB-VLS）策略，对SPECS化合物库进行大规模筛选，以寻找能够靶向STAT3 SH2结构域的小分子化合物。具体流程如下：
受体结构准备：对提取的平均结构进行优化，确保受体结构的合理性和准确性。
小分子化合物库准备：对从SPECS化合物库（www.specs.net）中获得的11万个小分子，使用LigPrep进行加氢操作，并生成所有的立体异构体和不同的质子化状态（pH：5.4-9.4）。
对接设置：首先采用高通量虚拟筛选（HTVS）模式，评估活性位点所有化合物的结合亲和力，选取打分结果排名前30%的化合物，在标准精度（SP）参数设置下进行重新对接和重新打分，保留打分结果排名前10%的化合物进行后续筛选。
过滤过程：根据过滤条件（1）化合物至少与一个pY + 0口袋残基（包括R609和S613）形成氢键，（2）在化学空间中的结构多样性，最终筛选得到110种化合物。
实验验证：对最终筛选出来的110种化合物进行生物实验验证，以确认其活性。
对虚拟筛选得到的110个化合物进行实验验证，测试它们抑制Kasumi-1细胞中粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 刺激的酪氨酸磷酸化STAT3 (pY-STAT3) 的能力，结果发现其中24个化合物对pY-STAT3的抑制作用大于50%。接着对这24个化合物进行表面等离子体共振（SPR），以确定它们抑制G-CSF刺激的pY-STAT3的能力是否是由于阻断STAT3与其固定的磷酸十二肽配体（EGFR pY1068-肽）的结合。结果发现8个化合物（SPEC-29、8、93、98、106、57、101和 85）可以有效抑制STAT与EGFR pY肽的结合（如表所示），五种化合物（SPEC-29、8、93、98和106）具有明显的抑制活性，IC50范围为2.7至19.0 μM。SPEC29和8被确定为最有效的化合物，IC50分别为2.7和4.1 μM。
然后，他们使用乳腺癌细胞系MDA-MB-468（已知表达高水平pY-STAT3并依赖STAT3进行生长）来评估化合物对构成性STAT3活性的抑制作用。通过Luminex技术测量处理后的细胞中pY-STAT3、总STAT3（tSTAT3）和GAPDH的水平，研究人员发现SPEC-29和SPEC-8是最有前景的化合物，能显著降低乳腺癌细胞系MDA-MB-468中pY-STAT3的水平，并抑制细胞增殖。生化实验进一步证实，这些化合物能抑制STAT3驱动的细胞生长，且其抑制活性与抑制pY-STAT3的能力相关。
本研究通过MD模拟和SB-VLS方法成功发现了针对STAT3 SH2结构域的强效小分子抑制剂，并通过实验验证了这些抑制剂的生物活性和作用机制。这些抑制剂具有潜在的临床应用价值，为抗癌药物的研发提供了新的方向。该研究成果已发表于学术期刊《Pharmacological research》。
Kong R, Bharadwaj U, Eckols T K, et al. Novel STAT3 small-molecule inhibitors identified by structure-based virtual ligand screening incorporating SH2 domain flexibility[J]. Pharmacological research, 2021, 169: 105637.